血脑屏障(blood-brain barrier，BBB) 是脑毛细血管阻止某些物质进入脑循环血，从而保持脑组织内环境基本稳定的一种特殊结构[1]，其对维持脑部内环境稳态具有重要作用，研究化合物BBB渗透性对中枢神经药物及治疗脑部疾病药物开发具有重要意义。考察化合物BBB渗透性的方法较多，一般分为体外法和体内法[2-4]，体外法主要有细胞模型以及基于96孔板的平行人工膜模型，体内法主要有脑组织匀浆法、脑微透析法及啮齿类动物原位脑灌注法。

1998年，Kansy[5]首次提出平行人工膜渗透分析法(parallel artificial membrane permeability analysis，PAMPA) ，该方法具有通量高，成本低，检测手段方便等特点，广泛应用于药物体外透过试验以及一致性评价研究[6-7]。PAMPA是1种可用于测定化合物通过(和保留于) 浓缩的带负电荷的磷脂双分子屏障的通透性的方法[8]，随着应用范围不断扩大，通过该方法构建了胃肠道吸收模型[9]、BBB转运模型[10]、角膜吸收模型[11]、皮肤吸收模型[12]等。PAMPA法的主要局限为只适用于转运方式为被动扩散的化合物，但是由于其具有高通量筛选等特点，可以作为化合物早期研发的处方筛选工具以及后续细胞及动物试验的参考。

Di等[13]基于溶解在十二烷中的猪脑提取物提出了PAMPA-BBB模型，并证明药物分子可以归类为脑部高渗透性及脑部低渗透性；Summerfiled等[14]报道基于猪脑质提取物的PAMPA-BBB模型[15]与大鼠原位脑灌注渗透性的比较，表明PAMPA-BBB模型具有很好的化学选择性。本研究建立1种新的PAMPA-BBB模型，该模型主要基于μFlux型药物渗透性测定仪，采用原位光纤与人工仿生膜相结合，简化实验流程，可实时监测化合物浓度。采用该模型考察氯丙嗪等化合物BBB有效渗透速率，将有助于化合物被动转运BBB渗透性的研究。

仪器与试药

Pion Inc公司μFlux型药物渗透性测定仪；Mettler Toledo公司Mettler XPE 206型十万分之一电子天平。

方法与结果

3.1 对照品储备液的配制

取各对照品适量，精密称定，用二甲亚砜溶解并稀释制成每1 mL中含氯氮平1.0 mg，咖啡因、利多卡因及维拉帕米3.0 mg，氯丙嗪、马普替林、卡马西平、普萘洛尔、安替比林及茶碱5.0 mg的单一溶液，即得。

3.2 数据处理

采用Au PRO软件(Pion Inc公司) ，二阶导数法校正后采用线性回归；统计学分析采用IBM SPSS Statistics 22及SAS 9.4软件。

3.3 测定方法

采用如图1所示装置，精密量取pH 7.4磷酸盐缓冲溶液与BSB缓冲液各16 mL，分别加入供给室与接收室中，两隔室间以面积为1.65 cm 2的人工仿生膜(20μL的BBB涂膜液浸润) 隔离。导入标准曲线，设置搅拌子转速、采样时间及温度，向供给室中加入对照品储备液，在200~720 nm波长范围内，采用光纤探头分别测定供给室和接收室中药物的浓度。

3.4 标准曲线的制备

精密量取各对照品储备液，分别用pH 7.4的磷酸盐缓冲液和BSB缓冲液稀释制成不同浓度的系列溶液，作为供给室对照品溶液和接收室对照品溶液。按照紫外分光光度法(2020年版《中华人民共和国药典》四部通则<0401>[16]) ，在200~720 nm波长范围内采用光纤探头，依次采集由低到高5个浓度的数据。各化合物供给室及接收室标准曲线测定结果如表1所示。各化合物在其供给室、接收室浓度范围内所得标准曲线的R²均大于0.999，说明该方法具有良好的线性关系。

3.5 重现性试验

按照“3.3”项下步骤进行试验，保持其他条件一致，分别于不同日期对维拉帕米BBB有效渗透速率进行测定，平行操作3次，取平均值。采用IBM SPSS Statistics 22版的t检验，对不同日期的2次试验结果进行统计学分析，考察仪器重现性。不同日期测定的维拉帕米有效渗透速率平均值分别为3.51×10^-4、3.72×10^-4 cm·s^-1，数据分析显示，2次测得的维拉帕米有效渗透速率无显著差异(P=0.091>0.05) ，说明仪器重现性较好。

3.6 BBB有效渗透速率测定

取各对照品储备液，照“3.3”项下测定方法进行试验，按照公式(1) 计算各化合物的BBB有效渗透速率。

其中，P_e为各化合物BBB有效渗透速率(cm·s^-1) ；C_t为供给室中化合物的平均浓度(μg·mL^-1) ；为单位时间内接收室中化合物浓度变化速率(μg·mL^-1·min^-1) ，即在所选时间段下化合物接收室浓度-时间曲线的斜率;V为接收室缓冲液体积(mL);A为人工仿生膜膜面积(cm ²) 。

氯氮平在该方法下BBB有效渗透速率曲线如图2所示。从图中可以看出，随着试验时间的延长，供给室化合物浓度逐渐降低，接收室化合物浓度逐渐升高，说明化合物透过人工仿生膜从供给室转移至接收室，模拟化合物以被动扩散的形式透过BBB的过程。

根据接收室中化合物浓度，选取目标时间段，拟合该段时间下化合物浓度-时间曲线，并获取该曲线斜率。将所测得的数据带入公式(1) 中，即得各化合物在该模型下测得的BBB有效渗透速率(见表2) 。

Tsinman等[17]基于96孔板建立1种PAMPA-BBB新模型，并证明该模型的理化选择性与大鼠原位脑灌流数据较为匹配，选择系数(selectivity coeffi⁃cient，SC) 为0.87。将本试验测定的P_e与Tsinman等[17]测定的跨膜渗透速率(P_m) 进行比较，采用SAS 9.4对log P_m、log P_e进行一元线性回归分析，拟合直线方程，并将所拟合的直线方程进行与直线Y=X进行比较。结果拟合直线方程为log P_m=1.00363×log P_e-0.13705，斜率即选择系数SC为1.00363，具有统计学意义(P<0.0001) ，说明P_e与P_m具有极显著的线性关系，并且该直线方程与直线Y=X无统计学差异(P=0.9322>0.05) ，说明本方法与文献[17]报道的基于96孔板建立的PAMPA-BBB模型测定结果具有较好的一致性(见图3) 。